南京英瀚斯(圖)-PCR實(shí)驗(yàn)室-陜西pcr

常規(guī)堿基分子量：
11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或10mm tris ph7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的ph值比較低（ph4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)定。
12.如何保存引物？
答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長(zhǎng)期保存。溶解后的引物-20度可以長(zhǎng)期保存。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的od數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。
二、操作步驟：
1. 所有在純化系統(tǒng)里使用的溶液當(dāng)日都需要經(jīng)過 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復(fù)至室溫后抽濾脫氣；
2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、緩沖液洗泵；設(shè)置流速和柱前警報(bào)壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個(gè)大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；
4. 當(dāng)柱子限壓在 0.3mpa，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時(shí)，ph valve 中的 restirtor 可以切換成 off line，即顯示 by-pass 狀態(tài)；
5. 當(dāng)需要通過儀器上樣環(huán)上樣時(shí)，將 w1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過倒吸樣品上樣；
6. 進(jìn)樣閥「inject」為上樣狀態(tài)。上樣結(jié)束可將進(jìn)樣閥切換回「load」?fàn)顟B(tài)。并用純水認(rèn)真清洗上樣環(huán)至少 3 次；將 w1 閥口處換回原來接頭閥門。
7. 純化結(jié)束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統(tǒng)。長(zhǎng)期不用，層析柱應(yīng)保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；
8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)傾倒廢液瓶里的廢液；
關(guān)于引物的常見問題匯總:1. 引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。dna合成儀有很多種， 主要都是由abi/pe 公司生產(chǎn)，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成儀，可實(shí)現(xiàn)99%的高合成率。無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，*消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。
亞磷酰胺三酯法合成dna，具有、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將dna固定在固相載體上完成dna鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′*二酯鍵連接。
步是將預(yù)先連接在固相載體cpg上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯反應(yīng)，熒光定量pcr，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)dmt，獲得游離的5′-羥基。
第二步，合成dna的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞*活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被dmt保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，用酐和1-咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的*三酯。
經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯脫去它的5′-羥基上的保護(hù)基團(tuán)dmt，pcr實(shí)驗(yàn)室，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察tca處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，陜西pcr，連接在cpg上的引物被切下來，通過opc，和page等手段純化引物，成品引物用c18濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測(cè)定od260定量，根據(jù)定單要求分裝。
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